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Imagerie

La plateforme d’imagerie de l’IMRB apporte son expertise aux personnels de l’IMRB et des utilisateurs extérieurs pour l’histologie et la microscopie. La plateforme d’imagerie est certifiée ISO 9001 depuis avril 2014. Cette certification garantie le suivi de règles de management de la qualité. La plateforme fournit le matériel depuis la préparation des échantillons jusqu’à l’observation en microscopie.
La plateforme se compose en 2 plateaux :

1) le plateau de préparation d’échantillon

2) le plateau de microscopie optique

1) Plateau de préparation d’échantillon

La plateforme met en œuvre un ensemble d’équipements permettant :

a) la préparation pour la microscopie optique

b) la préparation pour la microscopie électronique

 

a) Préparation pour la miscroscopie optique

La plateforme d’imagerie de l’IMRB fournit un service allant de la préparation de l’échantillon à la coupe et des équipements pour la coupe en paraffine ou en congélation. Ces équipements sont accessibles après formation et la réservation se fait par obm.inserm.fr.

 

-la réalisation de blocs de paraffine à partir d’échantillons fixés

Les tissus doivent être fixés au formol. La taille de l’échantillon ne doit pas excéder 4mm d’épaisseur sur 2cm de largeur et 2,5cm de longueur.

La chaîne de préparation commence par la déshydratation et l’imprégnation en paraffine des échantillons. Ces étapes sont réalisées par un automate Milestone Logos afin d’obtenir une imprégnation optimale des échantillons. Une fois les échantillons imprégnés en paraffine, ils sont inclus en un bloc de paraffine grâce à une station d’enrobage Thermo Scientific HistoStar.

-la réalisation de coupes
Les coupes sont obtenues avec un microtome manuel Shandon Finesse 325 à partir de blocs en paraffine. Les coupes peuvent avoir une épaisseur de 3 à 30µm. Les coupes sont réalisées sur des lames soit Super-Frost + (pour l’immuno-histo), soit des lames sans traitement (pour une coloration histologique ultérieure).

 

 

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De gauche à droite : automate d’imprégnation Logos, fontaine à paraffine HistoStar, microtome Shandon Finesse

 

 

 

 

Le personnel de la plateforme met à disposition un cryo-microtome Leica CM3050S et un microtome Shandon Finesse 325.  Le cryo-microtome Leica CM3050S permet des coupes à congélation jusqu’à -40°C pour une épaisseur de 5 à 100µm. Le microtome Shandon Finesse 325 permet des coupes en paraffine de 3 à 30µm. Le microtome est accompagné d’une plaque froide Histostar afin de refroidir et durcir les blocs et d’une plaque chauffante afin de lisser les coupes.

 

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De gauche à droite : microtome Finesse et plaque froide, cryo-microtome.

 

 

 

 

 

 

 

– la coloration

Les coupes obtenues sont colorées en hémalun de Mayer / éosine. Les noyaux sont visibles en violet et le cytoplasme des cellules en rose.

 

b) Préparation pour la microscopie électronique

La plateforme réalise aussi l’ensemble des opérations pour l’obtention de grilles en microscopie électronique en transmission.
-préparation des blocs de résine EPON
La fixation étant faite au glutaraldéhyde, le volume des tissus doit impérativement être de 1mmx1mmx1mm. Avant l’imprégnation en résine EPON, les échantillons sont soumis à une deuxième fixation au tetraoxyde d’osmium.

-réalisation de coupes semi-fines

Des coupes de 2µm sont faites puis colorées avec un mélange Azure II/bleu de méthylène. Elles permettent de sélectionner la zone d’intérêt afin de réaliser les coupes Ultra-fines.

-préparation de grilles pour la microscopie électronique en transmission

3 à 4 coupes de 60 à 150nm d’épaisseur sont déposées sur des grilles de cuivre. Après avoir été contrastées à l’acétate d’uranyle/citrate de plomb, les grilles sont prêtes pour l’observation.

 

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grilles_microscopie

 

 

 

 

 

 

 

Grilles pour la microscopie électronique en transmission

 

 

Blocs de résine EPON contenant différents

tissus apparaissant en noir.

 

Les observations se font sur le microscope électronique en transmission JEOL 100CXII de la plateforme de microscopie du LISA. Pour cela contacter Patrick Hausset (Patrick.Ausset@lisa.u‑pec.fr).

http://www.lisa.univ-paris12.fr/fr/instruments/33-analytical-instruments-laboratory/117-microscopes .

2) Plateau de Microscopie Optique

Le plateau de microscopie optique est dédié à l’acquisition en microscopie de préparations histologique ou fluorescente.
3 microscopes sont disponibles :
a) Microscope Axioplan 2
b) Microscope AxioImager M2
c) Microscope confocal LSM 510

 

Histo_fluo3

 

 

 

a) Microscope Axioplan 2 :

Ce microscope est dédié à l’acquisition en “lumière blanche” pour l’histologie. Il est équipé d’une caméra Zeiss MRc pour l’obtention d’image couleur et d’une série d’objectif (Plan-NeoFluar x5/0,16 ; Acroplan x10/0,25 ; x20/0,45. Plan-Neofluar x40/0,75 ; x63/1,25 huile) pour un large choix de grandissement. Les acquisitions se font avec le logiciel Zeiss Zen 2012.
Axioimager_M2b) Microscope AxioImager M2 :

L’AxioImager M2 est dédié à la microscopie en fluorescence. Il est doté de 4 cubes pour la fluorescence (DAPI, A488/FITC, A547/TRITC, To-Pro3/Cy5) couvrant les molécules fluorescentes les plus utilisées en recherche biologique. Les images sont obtenues par la caméra monochrome Zeiss MRm. Les objectifs sont : Acroplan x10/0,25 ; x20/0,45 ; Plan-Neofluar x40/0,75. Le logiciel Zen 2012 pilote le microscope et la caméra.

 

 

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c) Microscope confocal LSM 510 Meta :

Le microscope confocal est installé sur un microscope inversé Zeiss Axio Observer Z1. Il est équipé d’une platine motorisée et d’une chambre thermostatée. Les LASER (458nm, 477nm, 488nm, 514nm, 543 nm, 633nm) permettent de couvrir un large éventail de molécules fluorescentes utilisées en biologie. Ce système permet l’étude de distribution de marqueurs fluorescents, de colocalisation, l’analyse spectrale (séparation des spectres de fluorescence) et des applications en cellules vivantes (vidéo-microscopie, FRAP).

 

 

 

Certification ISO-9001

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Depuis avril 2014, la plateforme Imagerie est certifiée ISO 9001 ce qui facilitera son ouverture à des partenaires industriels.

La norme ISO 9001 définit une série d’exigences concernant la mise en place d’un système de management de la qualité dans un organisme, quels que soient sa taille et son secteur d’activité.



Publications récentes

C. Delestrain, S. Simon, A. Aissat, R. Medina, X. Decrouy, E. Nattes, A. Tarze, B. Costes, P. Fanen and R. Epaud. Deciphering the mechanism of Q145H SFTPC mutation unmasks a splicing defect and explains the severity of the phenotype

European Journal of Human Genetics (2017) 25, 779–782

Loïc Drévillon, André Megarbane, Bénédicte Demeer, Corine Matar, Paule Benit, Audrey Briand-Suleau, Virginie Bodereau, Jamal Ghoumid, Mayssa Nasser, Xavier Decrouy, Martine Doco-Fenzy, Pierre Rustin, Dominique Gaillard, Michel Goossens and Irina Giurgea, KBP–cytoskeleton interactions underlie developmental anomalies in Goldberg–Shprintzen syndrome

Hum. Mol. Genet. (2013) 22 (12): 2387-2399.

Laura H. Okagaki , Anna K. Strain , Judith N. Nielsen, Caroline Charlier, Nicholas J. Baltes, Fabrice Chrétien, Joseph Heitman, Françoise Dromer, Kirsten Nielsen.

PLoS Pathog. 2010; 6:e1000953

Lara Khouzami, Marie-Claude Bourin, Christo Christov, Thibaud Damy, Brigitte Escoubet, Philippe Caramelle, Magali Perier, Karim Wahbi, Christophe Meune, Catherine Pavoine, Françoise Pecker. Delayed Cardiomyopathy in Dystrophin Deficient mdx Mice Relies on Intrinsic Glutathione Resource

Am J Pathol. 2010; 177: 1356-64

Shao-yu Zhang1,2, Maud Kamal1,2,*, Karine Dahan1,2,*, André Pawlak1,2,*, Virginie Ory1,2, Dominique Desvaux1,2, Vincent Audard1,2, Marina Candelier1,2, Fatima BenMohamed1,2, Marie Matignon1,2, Christo Christov3,4, Xavier Decrouy4, Veronique Bernard5, Gilles Mangiapan6, Philippe Lang1,2,7,8, Georges Guellaën1,2, Pierre Ronco9,10,11, and Djillali Sahali1,2,7,8,†. c-mip Impairs Podocyte Proximal Signaling and Induces Heavy Proteinuria

Sci. Signal., 18 May 2010, Vol. 3, Issue 122, p. ra39

S Terry1,2,3, G Ploussard1,2, Y Allory1,2,4, N Nicolaiew1,2, F Boissière-Michot5, P Maillé4, L Kheuang1,2, E Coppolani1, A Ali1, F Bibeau5, S Culine1,2,4, R Buttyan6, A de la Taille1,2,4 and F Vacherot1,2. Increased expression of class III β-tubulin in castration-resistant human prostate cancer

British Journal of Cancer (2009) 101, 951–956. doi:10.1038/sj.bjc.6605245